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一种抗菌涂料抗菌性能检测方法是嘛

发布时间:2021-07-12 01:27:51 阅读: 来源:鱼竿厂家

一种抗菌涂料抗菌性能检测方法

一种抗菌涂料抗菌性能检测方法

2019年01月01日

0 前言

随着人民生活水平的提高,健康已逐渐成为提高生活质量的主要方面。SARS、禽流感等传染性疾病的流行,给国人敲响了警钟,控制和消除病菌的传播成为各个领域的研究热点。开发抗菌涂料对于促进公共卫生水平和提高国民健康水平具有重要意义中国涂料。江苏晨光涂料有限公司积极参加了中国建筑材料科学研究总院负责起草、归口于全国涂料和颜料标准化技术委员会的《抗菌涂料》行业标准的制订工作,并结合企业实际经验提出了若干修改意见。该行业标准已于2007 年1 月5 日通过审查。本文根据最新的《抗菌涂料》行业标准,针对我国中小型涂料企业的实际情况,介绍一种抗菌涂料抗菌性能检测的改进实验操作方法并进行了讨论。

1 实验部分

1.1 试验原料及仪器

1.1.1 材料

实验菌种:金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ATCC25922,江苏省卫生防疫站。纳米抗菌内墙乳胶漆、抗菌防霉抗藻防腐多功能纳米环保涂料、纳米银抗菌内墙涂料、纳米复合多功能内墙涂料、纳米抗菌紫外光固化漆、纳米抗菌水性木器漆,均为江苏晨光涂料有限公司产品。PBS 磷酸盐缓冲液(0.03 mol/L,pH=7.2~7.4)、

无菌检验用洗脱液、营养琼脂培养基,MH 琼脂培养基。

1.1.2 仪器设备

刻度吸管、毛细吸管、数字连续可调式移液器(简称移液枪,10~1 000 μL)、灭菌平皿、灭菌试管、灭菌移液管、接种环、酒精灯,微量加样器(1 μL)、聚乙烯薄膜(40±2)mm×(40±2)mm,厚度0.05~0.10 mm。离心机、电动混合器、恒温培养箱(37±1)℃、冷藏箱(0~5)℃、超净工作台、生物光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种保藏与活化

将菌种接种于营养琼脂培养基斜面上,在(37±1)℃下培养24 h 后,在(0~5)℃下保藏(不得超过1 个月),作为斜面保藏菌。将斜面保藏菌转接到平板营养琼脂培养基上,在(37±1)℃下培养24 h。试验时应采用 代内转接的新鲜细菌培养物。

1.2.2 菌悬液制备

用接种环从转接培养基上取少量(刮1~2 环)新鲜细菌,加入磷酸盐缓冲液(PBS)中,并依次做10 倍递增稀释液,选择菌液浓度为(5.0~10.0)×105 cfu/mL 的稀释液作为试验用菌液,按GB/T

4789.2 规定的方法操作。

1.2.3 涂料样板制备

涂料样板制备按GB/T 1756 进行,施涂和干燥方法照实际使用的厚度和方法。试验样板大小为50 mm×50 mm,可选涂料实际使用的底材(例如金属板和塑料板),底材不耐水或有吸湿性时可使用玻璃板。涂刷好的样板需在试验前进行消毒。

1.2.4 试验步骤

分别取0.2 mL 试验用菌液滴加在阴性空白样板(编号O)、无抗菌成分的涂料空白对照样品(编号A)和抗菌涂料样品(编号B)上,每个样271透风管道品至少做5 个平行实验。用灭菌镊子夹起灭菌覆盖膜分别覆盖在样品O、A、B 上,要铺平,使菌液均匀接触样品,置于灭菌平皿中,在相对湿度大于90%,温度(36±1)℃的恒温箱中培养24 h。将培养24 h后的样品O、A、B及其覆盖膜取出,分别放入已灭菌的100 mL烧杯中,并分别加入50 mLPBS 溶液,反复冲洗各样品及覆盖膜(最好用镊子夹起薄膜冲洗),充分摇匀后,得到稀释度为100 的菌悬液;取1 mL 稀释度为100 的菌悬液于灭菌试管中,用PBS 溶液进行10 倍梯度稀释,得到稀释度、、 的菌悬液。各取稀释梯度为100、、、 的菌悬液1 mL,接种于营养琼脂培养基(NA)中,在(37±1)℃下培养24~48 h 后活菌计数,按GB/T 4789.2 规定的方法测定活菌数。

1.3 检测结果计算和误差分析

1.3.1 抗菌率的计算

将阴性对照样品O、空白对照样品A和抗菌涂料样品B 培养24 h 后的实际回收活菌数值记为数值O、A 和B(cfu/片),按下式计算抗菌涂料的抗菌率:

抗菌率R(%)=100×(A-B)/ A

1.3.2 实验结果误差分析

样品A 的5 个平行活菌数值要符合 [(最高对数值- 最低对数值从进口到本人生产)/ 平均活菌数值对数值]不大于0.3;样品O 的实际回收活菌数值O 不小于1.0×105,且样品A 的实际回收活菌数值A 不小于1.0×104,否则试验结果无效。在活菌计数中因技术和操作而引起的菌落数误差率(平板间、稀释度间)不宜超过10%,误差率按以下公式计算。

(1)平板间(相同稀释度下的平行样板)误差率计算公式:

2 结果与讨论

按标准的抗菌检测方法实验操作[1,2],需要在1.2.2 和1.2.4 步骤中进行两次10 倍梯度稀释,以1.2.4 步骤为例,其具体操作方法为:先将试管按需要数量分组排列于试管架上,每管加入4.5 mL 稀释液。各组由左向右,逐管标上、、……等;再将菌悬液样本用电动混合器混合20 s(或在手掌上用力振敲80 次),随即用洗耳球和吸管吸取0.5 mL 加至 管内;将 管用电动混合器混合20 s(或在手掌上用力振敲80 次),混匀,再吸取出0.5 mL 加入 管内;依此类推,直至最后一管(每个样品均有3 组对照,每个对照5 组平行,梯度稀释至 即需45 个试管),而且全部操作过程均需在严格无菌状态下进行。该操作过程繁琐费时,工作量大,对实验人员操作水平和熟练程度依赖性极高,直接影响检测效率和结果的精度。

针对上述情况,在进行梯度稀释时,改为采用移液枪,如在1.2.4 步骤每次精确吸取50 μL,加入到装有450 μL 稀释液的1.5 mL 离心管中。由于移液枪只需一次性定容便可连续吸取相同体积,且离心管因体积小更易于振荡均匀,故而简化了操作,减轻了工作强度,降低了系统误差。移液枪的吸管和离心管均为一次性用品,还减轻了实验前准备和后处理的工作量。此外,采用预制培养基平皿再进行涂布平板活菌快速计数[],可将活菌计数时间缩短到10~12 h,从而提高了样品检测速率。以江苏晨光涂料有限公司生产的纳米抗菌水性木器漆对大肠埃希氏菌ATCC25922 为例,经改进后的方法与原方法的检测结果对比见表1。

表1 纳米抗菌水性木器漆不同抗菌率

注:1、包括实验准备、器材灭菌、无菌操作和器材清洗在内的整个操作过程所需时间。

2、指实验检测结果平均值与广东省微生物分析检测中心检测结果的差值。

在表1 中,分别采用了3 组熟练人员(指经过专业部门培训或有相关专业基础,并有12 个月以上的实验操作经验)和非熟练人员(无任何专业背景和基础,仅进行了3 周的临时培训)对同一批样品进行对比测试。由于采用移液枪和离心管进行菌液的梯度稀释,简化了实验操作,缩短了实验时间,还有效降低了平板间和稀释度间误差率,使非熟练人员的测试结果也达到了实验误差要求,从而减少了检测结果对人员操作的依赖性。采用改进方法的另一个优点是降低了实验过程中的杂菌污染率。在表1 中,改进方法的稀释度间误差率明显高于平板间误差率,而传统方法的结果正好相反。这是因为平板间误差率对人员操作更敏感,而移液枪的吸管和离心管均为有机塑料制品,相对于传统方法中使用的无机玻璃吸管和试管,其对菌体的吸附性较强,增大了倍率稀释过程的系统误差。

为进一步提高操作效率,减少梯度稀释的工作强度,采用移液枪和微量加样器配合进行了1∶10、1∶100 和1∶1 000 倍梯度稀释比的试验对比。如图1 所示,通过6 种不同抗菌涂料样品分别做3 种不同稀释梯度比的抗菌检测,发现随着稀释梯度比的增加,实验平均误差增大,特别是按1∶1 000 倍梯度比稀释检测时误差明显增大,其稀释度间误差率超过10%。在该稀释倍率下,需用微量加样器吸取1.0 μL 菌液加入到盛有999 μL 稀释液的离心管中,吸取的菌液体积过低,取样均匀性差,造成取样的相对误差被放大,而导致系统误差增大。因此检测

实用的稀释梯度倍率不宜超过100。

影响检测结果精度的另一个关键操作步骤是1.2.4 步骤中滴加菌液至样板上再覆膜。滴加的菌液中活菌数应在1.0×105~1.0×106cfu 之间,滴加的菌液体积应在50~200 μL 之间,低于50 μL 时易造成菌液中的水分在培养过程中蒸发损失过大而导致阴性空白对照样品的活菌数过低;超过200 μL 后易产生覆膜漂起脱落或菌液溢出覆膜边缘的现象而导致实验失败。样板底材的选择也需注意避免对检测结果产生影响,具有多孔结构、有吸水吸湿能力或有强吸附力的底材会使样板上的菌液洗脱不彻底,空白对照样品的活菌数偏低;有些金属底材易与菌液发生反应或渗出金属离子影响测试结果,故应尽量选用惰性耐水的底材制备样板。其任务道理是由伺服系统控制机电对江苏晨光涂料有限公司的纳米抗菌内墙乳胶漆、抗菌防霉抗藻防腐多功能纳米环保涂料、纳米银抗菌内墙涂料、纳米复合多功能内墙涂料、纳米抗菌紫外光固化漆和纳米抗菌水性木器漆等6 种抗菌涂料分别用传统方法和改进方法进行检测,其结果与广东微生物分析检测中心的权威检测结果的对比见表2。其中改进方法的结果更接近于广东

微生物分析检测中心的结果,这表明该检测方法精度可靠。

菌液中的水分在培养过程中蒸发损失过大而导致阴性空白对照样品的活菌数过低;超过200 μL 后易产生覆膜漂起脱落或菌液溢出覆膜边缘的现象而导致实验失败。样板底材的选择也需注意避免对检测结果产生影响,具有多孔结构、有吸水吸湿能力或有强吸附力的底材会使样板上的菌液洗脱不彻底,空白对照样品的活菌数偏低;有些金属底材易与菌液发生反应或渗出金属离子影响测试结果,故应尽量选用惰性耐水的底材制备样板。对江苏晨光涂料有限公司的纳米抗菌内墙乳胶漆、抗菌防霉抗藻防腐多功能纳米环保涂料、纳米银抗菌内墙涂料、纳米复合多功能内墙涂料、纳米抗菌紫外光固化漆和纳米抗菌水性木器漆等6 种抗菌涂料分别用传统方法和改进方法进行检测,其结果与广东微生物分析检测中心的权威检测结果的对比见表2。其中改进方法的结果更接近于广

东微生物分析检测中心的结果,这表明该检测方法精度可靠。

3 结语

根据《抗菌涂料》行业标准,参考《消毒技术规范》(2002 版)、《QB/T 2591—巴斯夫Infinergy发泡材料应用于阿迪达斯跑鞋2003 抗菌塑料——抗菌性能试验方法和抗菌效果》和《JC/T 897—2002抗菌陶瓷制品抗菌性能》中的抗菌性能检测方法,结合中小型涂料企业的实际和要求,以抗细菌性能检测为例,介绍了一种抗菌涂料的抗菌性能检测方法。通过改进操作方法,在保障检测结果精度的前提下,不仅提高了检测效率,还降低了测试结果对人员操作水平和熟练程度的依赖性。采用该抗菌性能检测方法,全套硬件设备投资可控制在10 万元以内,配备检测人员1~2 人,经2~3 周培训上岗,即可满足企业常规产品性能检测要求,非常适合于国内广大中小型涂料企业。

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